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PROUCTS LIST

KAPA在Illumina測序平臺上進(jìn)行靶向重測序而制備

發(fā)布時間: 2020-03-30  點擊次數(shù): 2047次

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KAPA hgDNA定量&QC試劑盒,包含人類基因組DNA樣品NGS文庫構(gòu)建前,所有基于qPCR定量及質(zhì)量評估的試劑。

KAPA hgDNA定量&QC試劑盒,是基于SYBR Green I染料法優(yōu)化的高質(zhì)量qPCR檢測試劑盒,包含KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix預(yù)先稀釋的一系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品,以及針對于人類基因組單拷貝的高度保守區(qū)域的不同位點所設(shè)計的引物預(yù)混液。小片段所對應(yīng)的引物,用于獲得定量的結(jié)果,而額外的引物,用于獲得在DNA樣本中可擴(kuò)增模板量(質(zhì)量高的DNA片段)的信息。這個試劑盒由此所產(chǎn)生的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(即Q-ratios),可以用于預(yù)測文庫的產(chǎn)量,或者對于如FFPE DNA這類樣本質(zhì)量變化很大的樣本的工作流程進(jìn)行調(diào)整。

產(chǎn)品特色

在單次檢測中,同時評估樣本量以及樣本質(zhì)量

可以將質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Q-ratios)與測序相關(guān)指標(biāo)相關(guān)聯(lián)

高性能的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix

預(yù)先稀釋好的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及可以直接使用的引物

多功能、易于自動化的工作流程

建立樣本質(zhì)量控制中低條件

指示樣品是否有足夠的量以及質(zhì)量來成功構(gòu)建文庫

未通過質(zhì)控的樣本,不再進(jìn)行后續(xù)文庫構(gòu)建以及測序步驟,從而節(jié)約時間和精力

通過檢測進(jìn)行測序的樣本 (Sequenced Sample) 和Q值不夠、未進(jìn)行測序的樣本(QNS,Not Sufficient) 各自的Q-ratios。

數(shù)據(jù)來源于Dartmouth-Hitchcock醫(yī)療中心(DHMC)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室。在DNA抽提后以及文庫構(gòu)建之前,使用KAPA hgDNA定量&QC 試劑盒,可以幫助使用者建立一個額外的質(zhì)量控制流程,用于在早期的過程中預(yù)測測序的質(zhì)量。DHMC在其擴(kuò)增子測序工作流程中,根據(jù)經(jīng)驗,使用Q129/41 bp>0.5和Q305/41 bp > 0.2作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

分析NGS文庫構(gòu)建工作流程

Q-ratios可以幫助判斷NGS文庫構(gòu)建工作流程中的瓶頸

對于FFPE樣本,文庫質(zhì)量和測序中質(zhì)量的主要限制因素是:起始DNA轉(zhuǎn)化成連接有接頭的文庫分子的轉(zhuǎn)化率不高

文庫的轉(zhuǎn)化率,為在Illumina測序平臺上進(jìn)行靶向重測序而制備

分別從樣本質(zhì)量參差的80-100 ng FFPE DNA樣本(橙色)和商用人類基因組DNA(灰色),使用KAPA LTP文庫構(gòu)建試劑盒來構(gòu)建測序文庫。FFPE DNA樣本在用Covaris打斷之前,用KAPA hgDNA定量&QC試劑盒進(jìn)行檢測,然后按照Q-ratios(DNA質(zhì)量)沿X軸升序排列。Q-ratios如圖中標(biāo)注。片段化的DNA(平均大小在180 bp左右)在建庫之前,用Qubit® HS dsDNA (Life Technologies) 進(jìn)行定量;在連接接頭、形成文庫分子之后,使用基于qPCR的KAPA文庫定量試劑盒進(jìn)行定量。結(jié)果顯示,F(xiàn)FPE樣本的文庫轉(zhuǎn)化率(Conversion Rate,起始DNA分子轉(zhuǎn)化成連接有接頭的文庫分子的百分比,%)明顯低于高質(zhì)量的DNA樣本,使得FFPE樣本的文庫分子多樣性受到限制,并且需要在文庫擴(kuò)增步驟中采取更多的循環(huán)數(shù)才能得到足夠多的文庫分子進(jìn)行靶標(biāo)捕獲,從而使FFPE樣本的文庫的重復(fù)率(duplication rate) 更高,靶標(biāo)覆蓋率(target coverage)更低。

從FFPE DNA樣本中獲得樣本制備的可操作數(shù)據(jù)

 

Q129/41 比值和測序中的關(guān)鍵指標(biāo)(如重復(fù)率)具有相關(guān)性

從250 ng Covaris打斷的FFPE DNA樣本(n=14)和對照組DNA(分別從培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮冰凍樣本和血液中提取,n=6),進(jìn)行手動文庫構(gòu)建。樣本按照Q129/41-比例升序在x軸上從左至右排列(FFPE樣本用黃色表示,對照組DNA用橙色表示)。文庫構(gòu)建采用的是NEBNext® 試劑(New England Biolabs),其中靶標(biāo)捕獲前和靶標(biāo)捕獲后的擴(kuò)增環(huán)節(jié)(10個循環(huán))采取KAPA HiFi 試劑盒。靶標(biāo)捕獲使用的是定制的SeqCap EZ panel (300 genes,0.9 MB)。 在Illumina HiSeq平臺上進(jìn)行了測序(2 x 100 bp)。FFPE樣本的平均靶標(biāo)覆蓋率(藍(lán)色點)是對照組的四倍(1,247X, vs. 301X),平均重復(fù)率(紅色點)是對照組的兩倍(75% vs. 38%)。Q129/41 比值 > 0.4 的FFPE樣本所產(chǎn)出的文庫能夠達(dá)到低測序質(zhì)量要求。

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默瑞(上海)生物科技有限公司,作為專業(yè)的生命科學(xué)產(chǎn)品推廣與服務(wù)商,以“創(chuàng)新,專業(yè),共贏”的理念,不斷強化服務(wù)體系,提升客戶體驗,以莫納生物產(chǎn)品為主線,結(jié)合國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品提供高標(biāo)準(zhǔn)完整解決方案,幫助科研客戶和生物技術(shù)企業(yè)高效創(chuàng)新,加速轉(zhuǎn)化,創(chuàng)造更多優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品,提升社會福祉,實現(xiàn)多方共贏。

  默瑞生物創(chuàng)立以來,已經(jīng)陸續(xù)導(dǎo)入TwistDx,enzymatics,KAPA BIOSYSTEMS,BioDynami,Jackson,Echelon,ChromoTek,Nanocs,Biotechrabbit,Lee Biosolutions, magtivio等優(yōu)質(zhì)品牌,逐步培育成為專業(yè)用戶的選擇。

 

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